Tuotteistaminen

Medical device - Biological (safety) evaluation

Lataa

Tuotteistaminen

7.1 Genotoksisuustestit

Genotoksisuustesteissä mitataan kemikaalin tai sen metaboliittien kykyä aiheuttaa sellaisia muutoksia suoraan perimään, genomiin, jotka vaikuttavat haitallisesti eliön toimintaan. Testejä voidaan tehdä sekä bakteerisoluilla, että eläinsoluilla ja eläimillä. Mutaatiotesteillä mitataan kemikaalin kykyä muuttaa solun DNA:ta tai RNA:ta, mikä yleensä johtaa vakaviin muutoksiin geneettisen tiedon kulkeutumisessa solun raketeisiin ja toimintoihin; solun jakaantumisessa, solulisääntymisessä ja seksuaalisen lisääntymisen mekanismeissa sekä yleisessä fysiologiassa.

Genotoksisuustestejä suositellaan tehtäväksi yhtenä ensimmäisistä testeistä, koska ne ovat suhteellisen nopeita ja ”halpoja” ja mahdollisten positiivisten tulosten seuraukset usein joko pysäyttävät materiaalin kehityksen tai materiaalin kemiaa on mietittävä uudestaan.

Ennen kuin tehdään päätös ryhtyä testaamaan materiaalin genotoksisuutta, on luonnollisesti oltava tiedossa testimateriaalin kemiallinen koostumus. Testaus ei ole tarpeen, jos implanttimateriaali sisältää vain sellaisia ainesosia, joista tiedetään, etteivät ne ole genotoksisia. Testaukseen on puolestaan syytä ryhtyä silloin, kun materiaalin kemiallista koostumusta selvitettäessä näyttää todennäköiseltä, että lopputuotteeseen sisältyy kemiallista ainetta, joka saattaa reagoida geeniaineksen kanssa, tai jos implantin kemiallinen koostumus on jostain syystä tuntematon tai uusi. Testejä tehtäessä on hyvä muistaa, että eri aineet saattavat vaikuttaa toisiinsa synergistisesti.

Genotoksisuustestaukset suoritetaan OECDn ohjeiden mukaan ”Guidelines for testing of chemicals”. Nämä on luettavissa sähköisesti OECDn sivuilla. Genotoksisuuden testaaminen sisältää sarjan erilaisia in vitro –testejä. Alla on esitetty kaksi erityyppistä testisarjaa, optio 1 ja 2. Optio 1:n mukaan edettäessä suoritetaan siis kolme OECDn mukaista testiä; optio 2:ssa kaksi testiä, joista toiseen sisältyy nk. ”mouse lymphoma assay” –testaus. Vähintään kahdessa testissä/optio pitää käyttää nisäkässoluja siten että lopputilanteessa mitataan eri parametrejä.

Testausvaihtoehdot

Optio 1 sisältää seuraavat testit: a) geenimutaatiotesti bakteereilla (OECD 471)
b) geenimutaatiotesti nisäkässoluilla (OECD 476)
c)  klastogeenisuustesti nisäkässoluilla (OECD 473)
Optio 2 sisältää seuraavat testit: a)  geenimutaatiotesti bakteereilla (OECD 471)
b)  geenimutaatiotesti nisäkässoluilla (OECD 476),
erityisesti hiiren lymfooma –testaus, johon sisältyy solukolonioiden määrän ja koon määrittely (tällöin tutkitaan sekä klastogeenisyyttä että geenimutaatioita).







 

 

Geenimutaatiotesti bakteereilla (OECD 471): Useilla eri bakterikannoilla suoritettava testi mittaa testiaineen vaikutusta suoraan bakteerin DNA:n ns. pistemutaatioina emäksen korvautumisena toisella, emäksen lisäämisenä tai poistumisena. Yksi bakteerrikanta mittaa lisääntyneen solunseinän läpäisykyvyn aiheuttamaa herkkyyttä suurten molekyylien mutaatiovaikutuksille. Käytettävät bakteerikannat on kehitetty erityisesti havaitsemaan eri kemikaalityyppien aiheuttamat mutaatiot. Pistemutaatiot ovat syynä moniin ihmisen geneettisiin sairauksiin ja eräisiin syövän syntymekanismeihin. Bakteereilla tehtäville testeille on olemassa laajat kansainväliset tietokannat ja menetelmiä on kehitetty myös vaikeasti testattaville kemikaaleille kuten helposti haihtuville kemikaaleille.

Geenimutaatiotesti nisäkässoluilla (OECD 476): In vitro testi nisäkässoluilla on suunniteltu havaitsemaan kemikaalien aiheuttamia suoria geenimutaatioita DNA:ssa. useimmat tällaisista kemikaaleista ovat karsinogeeneja eli syöpää aiheuttavia. Kokeessa voidaan käyttää erilaisia solulinjoja joista suositellut ovat L5178Y hiiren lymfoma solut, ja hamsterin solulinjat CHO, AS52,ja V79 sekä ihmisen TK6 lymfoblastoidisolut. Useimmin käytetyt menetelmät ovat tymidiini kinaasin (TK) ja hypoksantiini-guaniinifosforibosyylitransferaasin (HPRT) tai transgeenisen fosforibosyylitransferaasin (XPRT) aktiivisuuden mittaaminen. Näillä voidaan mitata erilaisia geenimuutoksia; esim. TK ja XPRT:n autosomaalinen paikantuminen voi osoittaa suuria deletioita joita x-kromosomiin paikantuva HPRT ei osoita.

klastogeenisuustesti nisäkässoluilla in vitro (OECD 473): Kokeen tarkoitus on havaita rakenteellisia muutoksia joko kromosomissa tai yksittäisessä kromatiinissa. Suurin osa kemiallisista mutageeneista aiheuttaa muutoksia yksittäisessä kromatidissa mutta esiintyy myös kromosomityyppisiä muutoksia, jotka aiheuttavat ihmisellä monia geneettisiä sairauksia paikantuessaan somaattisten solujen syöpää aiheuttaviin onkogeeneihin tai tuumori supressorigeeneihin .

Jos tulokset kaikissa edellä esitetyissä in vitro –testeissä ovat negatiiviset, ei ole perusteltua suorittaa in vivo –tason genotoksisuuskokeita eläimillä (tulee välttää turhaa koe-eläinten käyttöä tutkimuksissa!). Jos yksikin in vitro –testeistä on positiivinen, voidaan suorittaa joko in vivo –mutageenisuuskoe asian varmistamiseksi,  tai olettaa, että testattava materiaali on mahdollinen mutageeni.

Muita yleisesti käytetyt in vivo –genotoksisuustestit ovat
a)  mikrotumatesti jyrsijöillä  (OECD 474)
b)  metafaasianalyysi jyrsijän luuydinsoluilla (OECD 475
c)  järjestymätön DNA-synteesitesti nisäkkään maksasoluilla (OECD 486)

Päätös tietyn testin valinnasta pitää perustella ja dokumentoida. Jos jotakin muuta in vivo –genotoksisuustestiä käytetään edellä mainittujen lisäksi, tulee valinnan syyt perustella ja dokumentoida. Testin valinnassa voidaan tukeutua tehtyjen in vitro-testien tuloksiin.  Toksikologin asiantuntemusta on luonnollisesti käytettävä tässä vaiheessa.

Näytteen valmistus genotoksisuustesteihin suoritetaan ISO 10933 standardin nro 12 määräämällä tavalla materiaaliuutteesta, joka voidaan valmistaa myös nk. liioitetulla uutolla. Myös yksittäiset kemialliset aineet, joita sisältyy lopputuotteeseen, voidaan testata. Suurin testikonsentraatio tulee olla OECD:n säädösten mukainen kullekin testille. Jos materiaaliuutteen valmistuksessa käytetään liioiteltua uuttoa, uutto-olosuhteet valitaan niin, ettei materiaalin kemiallinen luonne muutu uuton aikana. Uuttoliuotin valitaan niin, että se sopii testisyteemiin, ja mahdollistaa maksimaalisen uuttumisen materiaalista. Liuottimen valinta perustellaan ja dokumentoidaan. Jos mahdollista, valitaan kaksi erilaista uuttoliuosta, joista toinen on polaarinen, toinen pooliton kemialliselta luonteeltaan. Myös implanttia in vivo -olosuhteissa ympäröivä, luontainen neste kelpaa uuttoliuottimeksi, kunhan se soveltuu käytettäväksi testisysteemissä.

Suositellut in vivo –testit ovat: OECD 474, 475, 478, 483, 484, 485 ja 486. (Huom. On kehitetty myös transgeenisiin eläimiin perustuvia genotoksisuustestejä, jotka saattavat osoittautua hyödyllisiksi medical device –testauksessa, mutta niitä ei ole vielä validoitu standardeiksi.)


Muuta huomioitavaa
OECDn säädöksissä on esitetty 15 erilaista testiä genotoksisuuden tutkimiseksi. Eri testien soveltuvuus tutkittavana olevan materiaalin testaamiseen harkitaan seuraavien seikkojen perusteella: minkätyyppinen geneettinen muutos halutaan testillä selvittää, ja mikä on kyseisen testin metabolinen kyky. Kansainvälistä konsensusta siitä, mitkä testit valitaan kulloisessakin tapauksessa, ei ole saatu aikaan. Käytössä ja kehitteillä on esim. mutageenisuustestejä, jotka eivät sisälly OECDn ohjeistukseen, mutta jotka silti saattavat olla hyödyllisiä.

Kemialliset aineet, jotka reagoivat DNAn kanssa, vaikuttavat monesti vaurioiden korjausprosesseihin, joiden häiriintyminen aiheuttaa muutoksia geenitasolla; kuten pistemutaatioita ja pieniä deleetioita, mitoosien häiriintymistä ja erilaisia mikroskooppisesti havaittavia kromosomimutoksia. Näiden vauriotyyppien syntyä voidaan tutkia erikseen erillisillä testeillä. Aineet, jotka ovat osoittautuneet genotoksisiksi, saattavat johtaa myös karsinogeneesiin. Osa genotoksisuustesteistä soveltuu  myös siis identifioimaan aineen karsinogeenisuuden riskiä. Nämä lyhytkestoiset testit eivät kuitenkaan pysty mimikoimaan kaikkia karsinogeneesin vaiheita, ja niillä voidaankin olettaa löydettävän vain se tapahtuma, joka johtaa karsinogeneesin alkamiseen.

Genotoksisten materiaalien karsinogeenisuustestaus ei ole tieteellisesti perusteltua. Genotoksisten materiaalien karsinogeenisuusriskiä voidaan pitää todennäköisenä, jolloin lisätestaus ei ole perusteltavissa. Jos katsotaan, että materiaalin kroonisen toksisuuden ja karsinogeenisuuden tutkiminen on aiheellista, testit suoritetaan, jos mahdollista, OECD 453 ohjeistuksen mukaisesti. Jos on päädytty tutkimaan vain karsinogeenisuutta, testit suoritetaan OECD 451 ohjeiden mukaisesti.